Gelelektroforese og DNA-profil

ProblemstillingVariablerRådataKonklusjon

DNA har negativt ladde fosfatgrupper og vandrer derfor mot den positive elektroden i et elektrisk felt. I agarosegel virker nettverket som en molekylær sil: under ellers like forhold vandrer kortere DNA-fragmenter vanligvis lenger enn lengre fragmenter. En fargestoffmodell kan vise elektroforese, men fargestoffers mobilitet bestemmes også av ladning, størrelse og form og kan ikke uten videre tolkes som DNA-fragmentlengde.

Hensikt og problemstilling

Hvordan varierer vandringsavstanden i agarosegel med kjent fragmentlengde for DNA-fragmentene i en størrelsesstandard når felt, gel, buffer og kjøretid holdes konstante?

Hypotese og prediksjon

Vi forventer at de korteste DNA-fragmentene vandrer lengst fra brønnen. Sammenhengen er ikke lineær over alle størrelser, derfor brukes en DNA-størrelsesstandard som referanse når ukjente bånd skal estimeres.

Variabler

• Uavhengig variabel: kjent DNA-fragmentlengde i størrelsesstandarden.
• Avhengig variabel: vandringsavstand fra brønnens startpunkt til midten av hvert bånd.
• Kontrollvariabler: samme geltype og gelkonsentrasjon, buffer, felt/spenning, kjøretid, temperatur, startposisjon, fargings-/visualiseringsmetode og målemetode.

Hvis klassen bruker fargestoffer i stedet for DNA, skal forsøket omtales som en elektroforesemodell. Da kan båndenes avstand sammenlignes, men de skal ikke brukes til å beregne DNA-fragmentstørrelse.

HMS og risikovurdering

Elektrisk utstyr og kjemikalier

Bruk bare skolens godkjente elektroforeseutstyr, buffer, prøver og fargestoffer. Lokket skal være på og kammeret håndteres etter produsentens/skolens prosedyre. Slå av og koble fra strømforsyningen før kammeret åpnes eller gelen berøres. Fargestoff, visualiseringsutstyr, personlig verneutstyr og avfall håndteres etter etikett, SDS og lokale rutiner.

Hvis visualisering bruker UV-lys, skal det bare skje med godkjent skjerming/verneutstyr og lærerens prosedyre. Ikke improviser UV-eksponering.

Utstyr

• Godkjent elektroforesekammer og strømforsyning
• Agarosegel og buffer etter skoleprotokoll
• DNA-størrelsesstandard og undervisningsprøver, eller godkjent fargestoffmodell
• Egnet pipetteringsutstyr
• Godkjent visualiseringssystem
• Linjal eller bildeanalyseverktøy

Metode og framgangsmåte

1. Kontroller hvilken side som er negativ og positiv elektrode. For DNA skal brønnene ligge nær den negative elektroden slik at DNA vandrer inn i gelen mot den positive elektroden.
2. Plasser gelen og bufferen nøyaktig slik skolens protokoll angir.
3. Last DNA-størrelsesstandard og undervisningsprøver i separate, merkede brønner uten å skade gelen eller blande brønnene.
4. Lukk kammeret og kjør elektroforesen med innstillinger og varighet fra den godkjente protokollen. Ikke åpne kammeret mens det er spenningssatt.
5. Slå av og koble fra strømforsyningen før gelen tas ut eller håndteres.
6. Visualiser båndene med skolens godkjente metode.
7. Mål avstanden fra samme referansepunkt ved brønnen til midten av hvert tydelig bånd i størrelsesstandarden. Registrer rådata før ukjente prøver tolkes.

DNA lastes nær den negative elektroden og vandrer gjennom gelen mot den positive elektroden.

Observasjoner og rådata

Bånd i størrelsesstandard	Kjent fragmentlengde	Vandringsavstand	Båndkvalitet / merknad
1
2
3
4
5+

Registrer også hvilke bånd som faktisk er synlige i hver undervisningsprøve. Ikke fyll inn et «forventet» mønster som om det var observert.

Databehandling og tolkning

1. Sorter størrelsesstandardens bånd etter kjent fragmentlengde og sammenlign med målt vandringsavstand.
2. Lag et diagram som viser fragmentlengde mot vandringsavstand. I ordinær agarosegelelektroforese brukes ofte logaritmen til fragmentlengden når en standardkurve konstrueres innenfor gelens brukbare område.
3. Estimer størrelsen på et ukjent DNA-bånd bare dersom det ligger innenfor området som størrelsesstandarden dekker og den samme gelen/betingelsene gjelder.
4. Ved sammenligning av båndmønstre: beskriv hvilke bånd som samsvarer og hvilke som ikke gjør det. Et visuelt samsvar alene er ikke identitetsbevis og sier ikke automatisk noe om sannsynligheten for at to prøver har samme biologiske opphav.

Kortere DNA-fragmenter vandrer vanligvis lenger enn lengre fragmenter under de samme gelbetingelsene.DNA-profil er mer enn «like striper»

Rettsgenetiske DNA-profiler bygger på validerte genetiske markører, kvalitetskontroll og statistisk vurdering. To visuelt lignende skolebaner er derfor bare et didaktisk mønstersamsvar, ikke et rettsmedisinsk bevis.

Feilkilder og usikkerhet

• Skadet brønn, overløp eller krysskontaminering kan gi svake, doble eller feilplasserte bånd.
• Ulik lastemengde kan påvirke båndintensitet, men intensitet er ikke det samme som fragmentlengde.
• Feil buffer, gel eller kjørebetingelser kan endre mobiliteten og gjøre sammenligning med standarden ugyldig.
• Smearing kan skyldes flere forhold og skal ikke uten videre tolkes som «mange små fragmenter».
• Måling fra ulike startpunkter eller til ulike deler av båndet gir måleusikkerhet.
• Fargestoffmodeller har andre mobilitetsbestemmende egenskaper enn DNA og har derfor begrenset biologisk validitet.

Reliabilitet

Reliabiliteten styrkes ved å gjenta kjøringen med samme standard og prøver, bruke samme måleregel hver gang og sammenligne uavhengige avlesninger. En størrelsesstandard i samme gel gjør det lettere å oppdage variasjon mellom kjøringer.

Validitet

For å undersøke sammenhengen mellom DNA-fragmentlengde og vandring må prøven faktisk være DNA med kjente fragmentlengder. En fargestoffmodell kan være valid for å vise at ladde molekyler kan separeres i et elektrisk felt, men ikke for å konkludere om DNA-størrelse. En enkel skolegel kan heller ikke alene validere personidentitet, slektskap eller kriminaltekniske konklusjoner.

Konklusjon

Konkluder fra egne data: vurder om kortere fragmenter i størrelsesstandarden faktisk vandret lenger enn lengre fragmenter under deres betingelser, og beskriv eventuelle avvik. Hvis ukjente bånd ble estimert, oppgi at estimatet gjelder innenfor standardens område og den aktuelle gelen. Skill tydelig mellom et observerbart båndsamsvar og en påstand om biologisk identitet.

Forbedring og gjentakelse

• Gjenta kjøringen og sammenlign avstanden til de samme standardbåndene.
• Standardiser pipettering, startpunkt, kjørebetingelser og bildeanalyse.
• Bruk flere referansefragmenter dersom ukjente størrelser skal estimeres.
• Hold tolkning innenfor området der båndene er tydelig separert.
• Bruk kun validerte biologiske prøver og analysemetoder hvis målet er mer enn en skolemodell.

Modellsvar etter egen konklusjon

Hvorfor vandrer DNA mot den positive elektroden?

Svar: Fosfatgruppene i DNA-ryggraden gir DNA en netto negativ ladning ved vanlige elektroforesebetingelser.

Hvorfor kommer korte DNA-fragmenter vanligvis lenger?

Svar: Agarosegelen virker som et nettverk av porer. Kortere fragmenter beveger seg lettere gjennom dette nettverket enn lengre fragmenter når andre betingelser er like.

Kan et fargestoff som vandrer langt kalles «lite DNA»?

Svar: Nei. Fargestoffers mobilitet påvirkes av ladning, størrelse og form. De kan brukes til å demonstrere elektroforese, men ikke som direkte DNA-størrelsesstandard.

Beviser like båndmønstre at to personer er samme person?

Svar: Nei. I en skoleøvelse kan båndsamsvar være en observasjon. Rettsgenetisk identifikasjon krever validerte markører, kvalitetskontroll og statistisk vurdering.

Relaterte sider

BioteknologiDNA, arv og evolusjonNaturvitenskapelig metodeAlle naturfag-forsøk